Стерилизация и хранения биопротезов .
Важнейшим фактором, влияющим на долговечность функции пересаженных клапанов, является метод их стерилизации.
Основными тербованиями предъявляемыми к методам консервации, являются:
- 1. обеспечение обсолютной стерильности;
- 2. снижение антигенности:
- 3. сохранение коллагеново-эластического комплекса ткани.
Блогадаря фндаментальным исследованиям A. Carpentier по проблеме химической консервации биоматериала, в 1968 г. был внедрен в клиническую практику предложенный им метод кондицонирования, который заключался в сочетанном применении метапериодата натрия и глутарового альдегида. Этот метод превосходил все предложенные ранее по антигенодепресивному, стерилизующему и сшивающему еффектами. Однако такие биопротезы через 2 – 3 года подвергаются массивной кальцификации. Оказалось, что метапериодат натрия повышает способность коллагена к кристализации фосфатов кальция.
Затем Уоррен Хэнкок удалил из технологической схемы метапериодат натрия, а чуть позже создал гибкий каркас для биопротеза.
В настоящее время почти во всех кардиохирургических клиниках мира применяют модификацию метода A. Carpentier: приготовленные клапаны помещают в 0,625% раствор глутарового альдегида минимум на 2нед. Максимальный срок хранения 1 год.
Но к сожалению, раствор глутарового альдегида повышает склонность биопротезов к кальцификации. Риск развития дегенеративных изменений и кальцификации биопротезов в различные сроки после операций у детей и молодых пациентов выше, чем у людей средного возраста.
A. Geha в 1979 г. провел анализ результатов применения у детей и подростков в трех униврситетских клиниках США. В сроки наблюдения от 10 до 54 мес у 20% из них развилась тяжелая дисфункция биопротезов, потребовшая реоперации.
В то же время кальцификация биопротезов не является уделом лишь молодых больных. Описаны кальцинозы биопротезов у больных в возрасте 33 – 70 лет без проявлений инфекционного эндокардита в послеоперационном периоде.
Б. А. Фурсов в 1982 г. выявил дисфункцию 3.9% биопротезов в митральной позиции на основе дегенерации и кальциноза створок.
-6-
Кальциноз биопротезов, как правило, развивается у больных, перенесших почечную недостаточность в послеоперационном периоде.
Для профилактики этого осложнения разработаны методы дополнительной обработки клапанов с использованием поверхностно - активных веществ, ферментов, дифосфанатов и фармакологическое воздействие на реципиента.
Было установлено, что чем моложе больной, тем выше риск кальцификации.
Ученные из Кемеровского кардиологического центра (ККЦ) считают,что это связано с повышенным уровнем кальцитонина у молодых людей и у женщин в период беременности и лактации. В эксперименте на крысах ими было показано, что при сниженной секреции кальцитонина в условиях постоянного теплового стресса кальцификация отсутствует. В контроле, при нормальном уровне этого гормона, динамика кальцификации носит обычный для данной модели характер.
Поиск методов преодоления основного лимитирующего использование биопротезов осложнения –кальцификации – ведется очень интенсивно. Но почти все разработки связаны с химической модификацией биоматериала, предварительно консервированного глутаральдегидом.
Исторически первый подход базируется на теоретической концепции, гласящей, что кальцификация связана с фосфолипидами мембран клеточных элементов клапана, которые якобы выполняют роль центров нуклеации гидроксиапатита. С целью удаления фосфолипидов были предложены
два пути:
. первый связан с обработкой биоматериала поверхностно – активными веществами,
. а второй – с удалением клеток с помощью ферментативного протеолиза. Однако клинические результаты показали, что такой подход не предотвращает кальцификации, лишь отдаляет начало процесса.
Следующим этапом стало интенсивное изучение возможности использования комплексообразующих соединений из группы дифосфонатов. Это аналоги постоянно присутствующего в организме естественного пирофосфата , профилактирующего эктопические кальцификации.
Наиболее удачной явилась идея ковалентной иммобилизации дифосфонатов на биоматериал, успешно апробированная в эксперименте. Однако ни где в мире эти разработки так и не дошли до клиники. Ученными из ККЦ этот подход был использован при создании технологии стадийной модификации биопротеза:
. первая стадия – обработка нативной ткани глутаральдегидом, в реззльтате чего происходит поперечная сшивка коллагена, укрепляющая структуру биоматериала. Отрицательным эффектом глутаральдегида является денатурация протеогликанов, которые в норме препятствуют тромбообразованию и кальцфикации.
. Поэтому на второй стадии – с помощью папаина удаляют протеогликаны и клеточные структуры, несущие остаточную антигенность.
-7-
. Третья стадия – на освободившиеся аминогруппы ковалентно иммбилизуют аминодифосфонаты, подавляющие кристаллзацию гидроксиапатита.
. На четвертой стадии – вместо денатурированных и удаленных протеогликанов формируют искусственный ионообменный гель, состоящий из альбумина и гепарина, что позволяет повысить тромборезистентность и уменьшить кальцификацию.
Начиная с 1987 г. в ККЦ была выполнена имплантация 18 таких биопротезов молодым больным. В сроки до 12 лет не наблюдалось ни одного случая кальцификации.
Параллельно этими же ученными проводились исследования в другом направлении. В конце 80-х годов была выдвинута, но не доказана гипотеза о том, что причиной кальцификации может явиться сам глутаровый альдегид за счет свободных альдегидных групп, не связавшихся с тканью в процессе консервации. Поэтому ученные ККЦ применили для обработки альтернативный сшивающий агент – диглицидиловый эфир этиленгликоля, относящийся к классу эпоксидов. Подлине углеводородной цепи он сопоставим с глутаральдегидом, но поперечная сшивка коллагена происходит за счет двух эпоксидных, а не двух альдегидных групп. На модели подкожной имплантации было показано, что диэпоксид придает биоматериалу высокую резистентность к кальцификации – содержание кальция в створках остается на метаболическом уровне на протяжении 3 месяцев. В те же сроки в створках, обработанных глутаральдегидом. происходит прогрессивное накопление кальция, соответствующее по количеству клиническим образцам, удаленным у больных через 10 – 12 лет после операции.
Однако механизмы кальцификации биопротезов оставались по - прежнему неясными. Ученные из ККЦ исследовали их на основании экспериментального сопоставления эффектов глутаральдегтда и диэпоксида. В соединительной ткани клапана присутствуют три основных компонента, которые могут быть точками кальцификации:
- 1. фибриллярные белки – в основном коллаген;
- 2. клеточные элементи;
- 3. протеогликаны.